細(xì)胞培養(yǎng)過程中，由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實(shí)驗(yàn)器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細(xì)胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。

       同時(shí)，由于支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實(shí)驗(yàn)者肉眼發(fā)覺。

       而支原體污染是個(gè)循序的過程，普通抗生素對其無效。因此，被支原體污染的細(xì)胞會持續(xù)受到影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

       本期文章中，我們介紹一下細(xì)胞被支原體污染后，*清除支原體的方法。

細(xì)胞被支原體污染，解決方案 

方法一：確認(rèn)細(xì)胞已被支原體污染，終止試驗(yàn)，丟棄所有被污染的細(xì)胞和耗材。

       重新復(fù)蘇細(xì)胞，注意選用未被污染的細(xì)胞株、血清和培養(yǎng)基，并規(guī)范操作。

方法二：對于珍貴的，樣品不可再得的細(xì)胞，或價(jià)格昂貴的種子細(xì)胞，不但無法丟棄，而且作為種子細(xì)胞，還需要**支原體污染。

      此時(shí)，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護(hù)細(xì)胞。

      目前世界上you效的方法是是德國的一款專li生物試劑，由Minerva公司生產(chǎn)，品名Mynox®。

      此試劑可在2-3小時(shí)內(nèi)將支原體主動殺除。特別適合細(xì)胞保種。

      Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養(yǎng)液中，可特異性地與支原體膜結(jié)合，改變膜通透性。通過此生物物理的方法，2～3小時(shí)內(nèi)，即可把細(xì)胞中的支原體殺除掉。因?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)與支原體膜不同，故Mynox®不會與細(xì)胞膜結(jié)合，因此無細(xì)胞毒性。

       注意：3小時(shí)后，需將此試劑洗脫，將細(xì)胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中，重新培養(yǎng)。

       此時(shí)，不應(yīng)使用PCR方法檢測細(xì)胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結(jié)果為假性強(qiáng)陽性。

Mynox®殺除支原體功能強(qiáng)大有效，但價(jià)格較貴。

方法三：對于已耗費(fèi)很多時(shí)間，大量擴(kuò)增起來的細(xì)胞，或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無法丟棄已有細(xì)胞。

但由于價(jià)格原因，又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細(xì)胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員還需要清除細(xì)胞上的支原體污染，讓實(shí)驗(yàn)得以往下推進(jìn)，以終獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

此時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可選用對支原體*的抑制劑，通過對細(xì)胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養(yǎng)，得以將支原體污染*清除，確保試驗(yàn)順利推進(jìn)，結(jié)果準(zhǔn)確。

*此類試劑眾多，筆者周圍的實(shí)驗(yàn)人做過很多嘗試，其中效果確切且性價(jià)比較高的當(dāng)屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是：通過抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成，達(dá)到抑制新的支原體增殖的目的。屬復(fù)合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®時(shí)，不需使用鏈青霉素。

操作步驟：

第yi步：研究發(fā)現(xiàn)，98%的支原體污染發(fā)生在細(xì)胞間隙。因此，首先要把細(xì)胞消化下來，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復(fù)三次。此時(shí)可將細(xì)胞上大部分的支原體去除，為進(jìn)一步加藥抑制做好準(zhǔn)備。

第二步：培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®，細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著細(xì)胞的換液逐步減少，通過4代左右的培養(yǎng)，細(xì)胞中的支原體基本可被*清除。

此試劑價(jià)格約2800元/50ml，1%濃度使用，可保證大量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)得以順利推進(jìn)。性價(jià)比較高，但祛除過程時(shí)間稍長。

有些細(xì)胞保種中心，當(dāng)珍貴細(xì)胞被支原體污染后，會將Mynox®和ZellShield®結(jié)合使用，效果確切，結(jié)果令人滿意。

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